研究人員使用DQ-BSA (一種僅在溶酶體中降解時發(fā)光的物質) 處理野生型 (WT) 和敲除型 (KO) hMGLs，并通過流式細胞術測量細胞內熒光強度。結果顯示，與WT對照組相比，SORL1 KO hMGLs的溶酶體降解能力下降。起初研究人員懷疑這是由于溶酶體酶活性降低所致。但由于整體溶酶體蛋白表達未受影響，研究人員轉而尋找其他解釋，重點研究缺乏SORLA的細胞中的活性變化。

溶酶體水解酶從高爾基體 (TGN) 運輸?shù)饺苊阁w的過程可通過一種由非依賴陽離子的甘露糖-6-磷酸受體 (CIMPR) 和多蛋白復合體retromer調控的途徑實現(xiàn)。為了確定SORLA缺失是否干擾該功能，研究人員使用針對溶酶體酶 (如cathepsin B、cathepsin D和HEXB) 的抗體，通過免疫細胞化學分析測量它們與TGN和晚期內體/溶酶體標記物的共定位情況。

結果顯示，SORL1 KO hMGLs與TGN標記物TGN38的共定位增加，而與溶酶體標記物LAMP1的共定位減少，表明溶酶體酶從TGN到溶酶體的運輸出現(xiàn)錯誤。接下來，研究人員研究了運輸?shù)鞍證IMPR，以確定SORLA缺失如何導致這些酶滯留在TGN中。通過共定位實驗和蛋白印跡分析，他們發(fā)現(xiàn)KO hMGLs中CIMPR表達降低，與LAMP1的共定位也減少。

綜合數(shù)據(jù)表明，SORL1敲除的hMGLs中，CIMPR依賴的運輸途徑受損。

該實驗隨后評估了在 SORL1 敲除的人類小膠質細胞（hMGLs）中，溶酶體內吞噬的底物是否因溶酶體分解代謝減少而積累。測量了熒光團標記的淀粉樣蛋白β 1-42 纖維（fAb）和染料標記的突觸體的積累，發(fā)現(xiàn)缺乏 SORLA 的細胞中這些物質增加。在用氯喹抑制分解代謝時，野生型（WT）和敲除型（KO）細胞均表現(xiàn)出這些底物積累增加。為了檢查 KO 細胞中積累是否與吞噬攝取增加有關，研究人員再次將它們與fAb、染料標記的突觸體以及 StressMarq 的淀粉樣蛋白β 1-42 寡聚體（目錄號 SPR-488）共同孵育。有趣的是，KO細胞對突觸體和纖維的攝取增加，但對寡聚體沒有增加，揭示吞噬作用的增加可能與底物特異性相關。吞噬細胞表面受體TREM2 和 P2Y6 在 SORL1 KO hMGLs 上顯示出細胞表面定位增加，表明 SORLA 維持細胞表面最-佳的吞噬受體水平。因此得出結論：吞噬底物的攝取增加和降解減少是導致SORL1 KO hMGLs 溶酶體功能障礙和壓力的關鍵因素。

圖1. 淀粉樣蛋白β 1-42 寡聚體(目錄號 SPR-488)的透射電子顯微鏡(TEM)成像。

由于研究人員發(fā)現(xiàn) CIMPR 調控的運輸途徑在 SORL1 KO hMGLs 中受損，他們進一步研究了溶酶體外排(LE)這一替代途徑是否能緩解溶酶體壓力。LE途徑是一個鈣依賴過程，使溶酶體能夠與質膜融合并將其內容物釋放到細胞外環(huán)境。此外，該途徑至關重要，因為它使小膠質或其他免疫細胞能夠在響應外部刺激時釋放促炎細胞因子和溶酶體酶，以維持細胞穩(wěn)態(tài)。Mishra等人發(fā)現(xiàn)該途徑在SORL1 KO hMGLs中也受損，加上KO細胞中溶酶體酶活性整體下降，導致細胞外酶活性水平降低。在接受促炎刺激 (如IFNγ或LPS) 后，SORL1 KO hMGLs也表現(xiàn)出多種促炎和抗炎細胞因子的分泌減少。

相關 StressMarq 產(chǎn)品

StressMarq Biosciences 是全-球領-先的專業(yè)蛋白制造商，提供用于模擬阿爾茨海默病和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的一系列蛋白。這些制備包括單體、寡聚體和纖維狀tau、α-突觸核蛋白和淀粉樣蛋白β，用于疾病建模和臨床前藥物發(fā)現(xiàn)。要了解更多關于 StressMarq 產(chǎn)品如何推動神經(jīng)退行性疾病研究進展，請訪問我們的產(chǎn)品引用頁面。